我司所提供ELISA KIT是典型的双抗夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒。预先将抗体包被在聚苯乙烯上，检测相抗体经生物素（biotin）标记，样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中的目的蛋白呈正相关。

一、 ELISA反应原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

二、试剂盒操作步骤

1.加样本和标准品：将梯度稀释过的标准品和稀释的待检样品加入博士德提供的酶标板中，置37℃ 孵育90min后，弃去孔内溶液。

2.加生物素标记抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素标记抗体

0.1ml，37℃ 孵育60min，TBS或PBS洗涤3次，每次浸泡60s。

3. 加亲和素-过氧化物酶复合物：于各反应孔中，加入新鲜稀释的亲和素-过氧化物酶复合物0.1ml，37℃ 孵育30min，TBS或PBS洗涤5次，每次浸泡90s。

4.加底物液显色:于各反应孔中加入TMB底物溶液90ul,37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入终止液100ul。

6.用酶标仪在450nm测定O.D.值

三、ELISA常用标本类型及其处理

血清：用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心20分钟左右，收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

血浆：根据试剂盒要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，与血液混合10-20分钟后，离心20分钟左右，，收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

尿液、胸腹水、脑脊液：用无菌管收集，离心20分钟左右，收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

细胞培养上清：检测分泌性成分时，用无菌管收集，离心20分钟左右，收集上清。检测细胞内成分时，用PBS稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并释放细胞内成分，离心收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

细胞：检测细胞成分时，对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，加入适当裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍，加入适当裂解液，用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000-14000离心3-5分钟，取上清，即可进行后续操作。

组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS或组织萃取试剂，缓冲液中可加入蛋白酶抑制剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分，离心收集上清于-20℃或-70℃保存，若有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

四、注意事项

1.血清标本采集时，应避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化氢酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

2.标本应新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。保存过久可发生聚合在ELISA中可使本底加深。

3.酶标板在操作过程中避免干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。4.为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。

5.封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

6.用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。