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免疫组化难题——背景染色问题
文章来源:江苏麦莎实业有限公司   添加时间:2020/10/22 17:00:13 点击率:1409

1、背景染色较深的原因有哪些?

(1)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。

(2)抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时,而是 30 分钟,因此,要根据染色结果进行调整。

(3)DAB 变质和显色时间太长:DAB 最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的效力,未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实,但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时间过长。

(4)组织变干:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。

(5)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于 24 小时):原因上不清楚,但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在 4??C 冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此,不可存放时间太长。

(6)一抗变质、质量差的多克隆抗体:注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

2、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长?

答:返蓝可以用碱性溶液(PBS/Na2 HPO4/淡氨水)或 45 度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化 5~10 min。淡氨水有人用 50 ml 自来水+三四滴的氢氧化铵。

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